Naslov Karakterizacija i kloniranje SNX9 fuzioniranog sa zelenim fluorescentnim proteinom u staničnoj liniji DAMI i HEK293 Naslov (engleski) Characterization and cloning of SNX9 fused with green fluorescent protein in DAMI and HEK293 cell line Autor Eni Tomović Mentor Antonija Jurak Begonja (mentor)Član povjerenstva Jelena Ban (predsjednik povjerenstva)Član povjerenstva Ivana Ratkaj (član povjerenstva)Član povjerenstva Antonija Jurak Begonja (član povjerenstva)Ustanova koja je dodijelila Sveučilište u Rijeci Datum i država obrane 2019-09-19, Hrvatska Znanstveno / umjetničko BIOTEHNIČKE ZNANOSTI Sažetak Trombociti, najmanje krvne stanice koje imaju važnu ulogu u hemostazi, nastaju u koštanoj srži iz prekursora, megakarocita. U procesu nastanka trombocita reorganizacija aktinskog citoskeleta je esencijalna. Sortirajući neksin 9 (engl. Sorting nexin 9, SNX9) je višefunkcijski protein koji koordinira promet na membrani i dinamiku aktina unutar stanica. SNX9 aktivira proteine Wiskott-Aldrich sindroma (engl. Wiskott–Aldrich Syndrome protein, WASP) koji zauzvrat iniciraju polimerizaciju aktina putem Arp2/3 kompleksa. Arp2/3 kompleks se veže za aktinske filamente kako bi se započelo grananje F-aktinskih niti. Kako bi polimerizacija aktina bila potpuno uspješna potrebne su male Rho GTPaze te PI(3)P i PI(4,5)P2, važni signalni lipidi.
Ovim radom ispitana je ekspresija i unutarstanična lokalizacija SNX9 u ljudskoj megakarioblastičnoj staničnoj liniji (DAMI). Naši glavni rezultati pokazali su kako je ekspresija SNX9 povećana u diferenciranim DAMI stanicama te kako SNX9 lokalizira ili perinuklearno ili je jednoliko raspršen po citoplazmi stanice. U diferenciranim DAMI stanicama SNX9 je često bio prisutan u obliku diskretnih vezikula koje su dijelom kolokalizirale s F-aktinom. Nadalje, kako bi dodatno ispitali lokalizaciju i učinak egzogene ekspresije SNX9, subklonirali smo SNX9 fuzioniran sa zelenim fluorescentnim proteinom (engl. green fluorescent protein, GFP) u retroviralni vektor (engl. Murine stem cell virus vector, MSCV). Točna veličina GFP-SNX9 i njegova lokalizacija je potvrđena u HEK293T staničnoj liniji. Ekspresija GFP-SNX9 u DAMI stanicama je pokazala podjednaku lokalizaciju kao endogeni SNX9. GFP-SNX9 je povećao polimerizaciju aktina (F-aktin) u nestimuliranim DAMI i HEK293T, ali ne i u diferenciranim DAMI stanicama. Dodatno, ekspresija GFP-SNX9 povisila je razinu PI(4,5)P2 u DAMI stanicama. Ovi rezultati ukazuju na to da bi SNX9 mogao biti uključen u proces polimerizacije aktina u DAMI stanicama te bi daljnja istraživanja mogla pomoći u definiranju uloge SNX9 u formiranju trombocita.
Sažetak (engleski) Platelets, the smallest blood cells that play a major role in hemostasis, develop within the bone marrow from precursor cells, megakaryocytes. In this process, extensive rearrangement of actin cytoskeleton is crucial for bending and branching of proplatelet extensions. Sorting nexin 9 (SNX9) is a multifunctional scaffold protein involved with coordination of membrane trafficking and actin dynamics. More specifically, SNX9 activates Wiskott-Aldrich Syndrome protein (WASP) which in return initiates actin polymerization via activation of the Arp2/3 complex. The Arp2/3 complex binds to actin filaments and starts the formation of branched F-actin fibers. In order for actin polymerization to be successful, small Rho GTPases and PI(3)P and PI(4,5)P2, important signaling lipids, must be involved.
In this thesis, we investigated the expression and intracellular localization of SNX9 in human megakaryoblast cell line (DAMI). Our main results showed that expression of SNX9 increased with differentiation of DAMI cells and that SNX9 localized either perinuclearly or was dispersed throughout the cell cytoplasm. In differentiated DAMI cells SNX9 was often present in discrete vesicles that partially colocalized with F-actin. Moreover, in order to investigate localization and effect of exogenous SNX9, we subcloned SNX9 fused with green fluorescent protein (GFP) into retroviral murine stem cell virus vector (MSCV). Correct size of GFP-SNX9 and its localization were confirmed in HEK293T cell line. Expression of GFP-SNX9 showed same localization to endogenous protein in DAMI cells. Expression of GFP-SNX9 increased actin polymerization in HEK293T and undifferentiated DAMI, but not in differentiated DAMI cells. Furthermore, GFP-SNX9 increased PI(4,5)P2 levels in DAMI cells. These results suggest that SNX9 could be involved in the process of actin polymerization in DAMI cells. Therefore, a further study might help in better understanding of SNX9 role in platelet formation.
Ključne riječi
DAMI stanice
SNX9
polimerizacija aktina
PI(4
5)P2
Ključne riječi (engleski)
DAMI cells
SNX9
actin polymerization
PI(4
5)P2
Jezik hrvatski URN:NBN urn:nbn:hr:193:962872 Projekt Šifra: 2400 Studijski program Naziv: Biotehnologija u medicini Vrsta resursa Tekst Način izrade datoteke Izvorno digitalna Prava pristupa Pristup korisnicima matične ustanove Uvjeti korištenja Repozitorij Repozitorij Odjela za biotehnologiju Sveučilišta u Rijeci Datum i vrijeme pohrane 2019-09-19 07:51:51
